sh-T さま

ダイコンの根に含まれるカタラーゼの測定についてのご質問ですが、ダイコンの細胞でカタラーゼは細胞小器官(細胞顆粒)であるペルオキシゾームに(時にペルオキシゾームの蛋白質の50％以上を占める)高い含量で局在しています。しかし、ペルオキシゾームは細胞の機械的な破砕に弱いためダイコンをおろす過程で、酵素液にカタラーゼの大部分が含まれていると思われます。ご存知のようにカタラーゼは活性酸素の一つである過酸化水素を不均化反応で消去し（2 H₂O₂ → O₂ + 2 H₂O）、細胞の酸素障害を防ぐ上で重要な酵素です。
最初に酵素液にH₂O₂を加えたときカタラーゼ反応によって酸素が発生しますが、予想外の二つの結果は共に、この間にカタラーゼがH₂O₂によって活性を失ったためと考えられます。①の結果は、最初の反応でH₂O₂がすべて消去される前にカタラーゼが失活し、そのため未反応のH₂O₂が反応済み液に(多量に)残存していたためと思われます。そこに新しい酵素液を加えるとそのカタラーゼによって酸素が発生したと考えられます。②の結果は最初の反応でカタラーゼが失活したため、反応済み液にH₂O₂を加えてもさらにカタラーゼ反応による酸素発生はなかったと考えれば説明できます。
最初の反応でカタラーゼがなぜ失活したかの第一の原因はここで酵素液に加えたH₂O₂の濃度が高かったためです。反応液でのH₂O₂濃度は、約3.5%, 1Mになりますが、カタラーゼはH₂O₂によって失活しやすいため、正確なカタラーゼの活性を求めるためには、ここで用いられた濃度の少なくとも1%, 10 mM以下のH₂O₂で、しかも、H₂O₂添加後、できるだけ短時間（１分以内）での酸素発生、または、H₂O₂の減少から活性を測定することが必要です。この程度の濃度でもH₂O₂によってカタラーゼは少しずつ失活するため、正確に酵素液のカタラーゼ活性を測定するため、短時間での測定(初速の測定)が求められています。
ところで、H₂O₂を消去するカタラーゼがなぜ基質そのものによって失活するのでしょうか。実際の細胞の中でのH₂O₂濃度は10 mMよりさらに数桁低い濃度に保たれています。10 mM H₂O₂でさえ細胞にとって危険であり、多くの酵素が活性を失い酸素障害を引き起こします。もちろん、カタラーゼもペルオキシダーゼと共に細胞内のH₂O₂を低く保つ上で大きく寄与していますが、それがうまくいかないでH₂O₂濃度が上昇するとカタラーゼが失活しさらに酸素障害が促進されることになります。
最初の反応でH₂O₂が完全に消去されたかどうかを証明するため、反応済み液を用いて①②の実験をされたと思いますが、このためには最初に加えるH₂O₂濃度を酸素の泡が観察できるぎりぎりの濃度に低くし、カタラーゼが失活する前にH₂O₂が完全に消去される条件にすることが必要です。H₂O₂を加えて泡が出るのはカタラーゼの検出には簡単で特異性の高い方法で、酵素の力を生徒さんに示すためにすぐれた方法です。岡山大学の高原先生が、世界で最初にヒトの無カタラーゼ症を見出されたのも、外傷をオキシフル(医療用H₂O₂)で消毒したとき泡が出ない患者さんがおられることに気づかれたのが、発見のきっかけでした。